ADN microbiano – ¡Purificación fácil!

Desafíos de la purificación de ácidos nucleicos de bacterias o levaduras 

Las bacterias y las levaduras son dos de los grupos principales clasificados como microorganismos. Las bacterias son organismos unicelulares procariotas sin orgánulos unidos a la membrana ni núcleo. Se pueden dividir en bacterias grampositivas o gramnegativas, según sus composiciones de membrana. Las levaduras, por otro lado, son organismos unicelulares eucariotas con orgánulos celulares y un núcleo. Uno de sus bloques de construcción de membrana es la quitina. 

Para obtener los mejores resultados posibles para su muestra, lea a continuación sobre los desafíos y nuestras soluciones sugeridas para purificar ácidos nucleicos de bacterias y levaduras utilizadas en laboratorios de investigación o como cultivo bacteriano para procesos industriales.

Nuestras soluciones para sus desafíos

Lea a continuación sobre nuestras soluciones seleccionadas de lisis y purificación de ácidos nucleicos para sus muestras. También encontrará información adicional sobre la estructura de la pared celular de las bacterias y las levaduras, que desempeña un papel esencial en la lisis y la purificación de ácidos nucleicos. 

• Diferencias importantes en la estructura de la pared celular
• Soluciones de purificación de ADN de bacterias y levaduras
• Soluciones de lisis para bacterias y levaduras
• Soluciones para microorganismos de cultivo iniciador utilizados en procesos industriales

Diferencias importantes en la estructura de la pared celular

La pared celular protege la célula, proporciona estructura y soporte. Las paredes celulares de todos los microorganismos difieren en su composición. Para la levadura y las bacterias, la principal diferencia en la composición de la membrana es la presencia de quitina en las paredes celulares de la levadura, mientras que en las bacterias la pared celular está hecha de peptidoglicano. Comprender la estructura de la pared celular en detalle también ayudará a elegir la mejor opción de lisis para su muestra. Lea más sobre las diferencias estructurales de las paredes celulares de bacterias y levaduras a continuación.

Bacterias

Mediante la tinción de Gram, las bacterias se pueden clasificar en dos grupos, debido a la estructura de peptidoglicano en sus paredes celulares. La estructura de la membrana también es importante al elegir un método de lisis. Haga clic aquí para obtener más información sobre las sugerencias de lisis para bacterias gramnegativas y grampositivas.

Gram-positivas

Las bacterias Gram-positivas muestran una estructura de membrana compleja que incluye peptidoglucanos, polisacáridos, ácidos teicoicos y proteínas. Con 40 a 80 capas de peptidoglucano, la pared celular Gram-positiva es relativamente gruesa en comparación con las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas.

Clasificación de las bacterias Gram-positivas

Las bacterias Gram-positivas se dividen en los siguientes grupos según su forma

1. Cocos, como Staphylococcus o Streptococcus

2. Bacilos, que pueden dividirse aún más en formadores de esporas, como Bacillus y Clostridia o no formadores de esporas, como Listeria y Corynebacterium

Gram negativos

Las bacterias Gram-negativas aparecen en rojo tras la tinción de Gram. Además de su composición de membrana peptidoglicana estructural, que las hace menos susceptibles a ciertos antibióticos como la penicilina, también están protegidas mediante una cápsula externa. Esta cápsula externa permite una mayor protección contra los antibióticos y puede liberar endotoxinas cuando se interrumpe.

Clasificación de las bacterias Gram-negativas

Las bacterias Gram-negativas se pueden dividir en:

1. Diplococos, que utilizan o no la maltosa, como Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis, respectivamente.

2. Cocobacilos, como H. influenzae o B. pertussis

3. Bacilos que fermentan o no la lactosa, como E. coli o no fermentan la lactosa pero producen H2S, como S. proteus 

4. Forma de coma, oxidase positivos, como V.cholerae o H.pylori

Levaduras

La estructura de la pared celular de hongos o levaduras tiene cuatro características: glucanos, quitina, glicoproteínas y melanina. Las diferencias en la composición de los cuatro permiten la caracterización de diferentes especies.

Glucanos

• Glucano representa 50–60% de su pared celular
• Los glucanos más abundantes son unidades de glucosa enlazadas en 1,3 (65–90%)
• Los componentes de la pared celular están unidos covalentemente a las unidades de 1,3-glucano

Quitina

• El contenido de quitina en la pared celular fúngica varía debido a su fase morfológica (es decir, gemación)
• La quitina puede constituir hasta el 1-2% de la pared celular
• Los hongos filamentosos muestran hasta el 12% de quitina en su pared celular

Soluciones de lisis para bacterias y levaduras

Lisis mediante enzimas líticas

Sugerencias de lisis enzimática para bacterias

Proteinasa K

Proteinasa K está disponible en dos versiones diferentes

• Proteinasa K liofilizada
• Proteinasa K líquida

Sugerencias de lisis enzimática para levaduras

• Líticas o zimolasa
  

Soluciones de lisis mecánica

Soluciones de lisis mecánica para bacterias

Tubos de perlas MN

Tubos de perlas MN Tipo B, perlas de vidrio de 40-400 µm

Los tubos de perlas MN Tipo B están disponibles en los siguientes formatos:

• Tubos de perlas MN Tipo B 2 mL
• MN 96 pocillos Tipo B
• Tubos de perlas MN a granel, B1 y B2

Soluciones de lisis mecánica para levaduras

Tubos de perlas MN

Tubos de perlas MN Tipo C, perlas de corindón de 1-3mm

Los tubos de perlas MN están disponibles en los siguientes formatos

• Tubos de perlas MN Tipo C, 2 mL
• Tubos de perlas MN a granel

Soluciones para microorganismos de cultivo iniciador utilizados en procesos industriales

Para la fermentación de alimentos, se utilizan diversas especies de bacterias o levaduras. Para la producción de carne, queso o productos lácteos, se utilizan principalmente bacterias. Las levaduras se utilizan para la producción de pan, cerveza o vino.

Para cada uno de los productos mencionados, las bacterias o levaduras que se utilizan en un cultivo bacteriano se seleccionan y caracterizan cuidadosamente.

Cultivos iniciadores - Bacterias

• Lactococcus lactis, utilizado para productos lácteos o queso
• Streptococcus thermophilus, utilizado para queso o yogur
• Pediococcus halophilus, utilizado para salsa de soja
• Pediococcus acidilactici, utilizado para salchichas o fermentación de vegetales
• Oenococcus oeni, utilizado para vino

Cultivos iniciadores - Levaduras

• Saccharomyces cerevisisiae, producción de pan, cervezas de ale o vino
• Saccharomyces calsbergensis, cervezas de tipo lager
• Kluyveromyces spp., producción de kéfir
• Candida spp., producción de kéfir
• Brettanomyces bruxellensis, producción de cerveza
• Brettanomyces spec., producción de sidra o vinos de manzana
  

Soluciones para cultivos iniciadores

NucleoMag ADN Bacterias

• adecuado para el uso de cultivos iniciadores
• aislamiento de cultivos diversos
• totalmente automatizable

El kit NucleoMag ADN Bacterias puede utilizarse manualmente junto con el NucleoMag Sep Mini para preparaciones individuales o con el NucleoMag SEP para 96 muestras. La automatización es posible en las plataformas de automatización comunes como Eppendorf, Hamilton, Tecan. Por favor, contacte con nuestro Soporte Técnico para obtener más información.

Si se necesita una lisis mecánica, los tubos de perlas MN están disponibles como versión de tubo individual o como placa de perlas MN 96. Para obtener más información sobre los tubos de perlas MN haga clic aquí.

Soluciones de purificación de ADN de bacterias y levaduras

NucleoSpin ADN Microbiano

• Adecuado para una gran variedad de materiales de partida
• Tubos de perlas MN Tipo B incluidos para lisis eficiente – compatibles con muchos dispositivos de disrupción
• Procedimiento rápido y fácil – Solución tampón de lisis con Proteinasa K líquida incluida, no se requiere enzima adicional

Procedimiento NucleoSpin Microbial DNA

NucleoSpin Microbial DNA está diseñado para la rápida de ADN genómico altamente puro de microorganismos (bacterias gram-negativas y gram-positivas, levaduras y hongos).

El NucleoSpin Microbial DNA utiliza MN Bead Tubes Type B (perlas de vidrio; incluidas en el kit) en combinación con Proteínasa K líquida, y un dispositivo de disrupción común, por ejemplo, un molino oscilante, para lisar diferentes materiales de muestra con un solo procedimiento. El procedimiento es rápido, simple y se pueden obtener de ADN fiablemente altos de una amplia gama de muestras microbianas. Alternativamente, los MN Bead Tubes se pueden pedir por separado. 

Se logran condiciones de unión de ADN apropiadas a las Columnas NucleoSpin Microbial DNA mediante la adición de grandes cantidades de (Binding Buffer MG) al lisado. Los contaminantes se eliminan mediante dos eficientes pasos de lavado. Posteriormente, el ADN se con un ligeramente alcalino y está listo para su uso en reacciones posteriores.

Recuperación eficiente de ADN de diferentes microorganismos

Se aisló ADN con el kit NucleoSpin Microbial DNA y el tubo con perlas MN Tipo B (incluido en el kit) o el tubo con perlas MN Tipo C (ver información de pedido). 100 ng de ADN por preparación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, mostrando ADN de alto peso molecular, sin contaminación por ARN ni degradación de ADN. 

1. Escherichia coli, tubo con perlas MN Tipo B 

2. Vibrio fischeri, tubo con perlas MN Tipo B 

3. Bacillus subtilis, tubo con perlas MN Tipo B 

4. Corynebacterium glutamicum, tubo con perlas MN Tipo B 

5. Saccharomyces cerevisiae, tubo con perlas MN Tipo C

Comparación de los tiempos de preparación

Se comparó el tiempo de preparación del kit NucleoSpin Microbial ADN con productos de la competencia procesando *Bacillus subtilis*, *Escherichia coli* y *Saccharomyces cerevisiae*. El kit NucleoSpin Microbial ADN muestra tiempos de preparación más cortos en los tres casos.

Son posibles diversas aplicaciones en combinación con los tubos de perlas MN.

ADN fue aislado exitosamente de los microorganismos mencionados por el kit NucleoSpin Microbial DNA. Los tubos de perlas MN fueron probados para los materiales de muestra mencionados en un Retsch Swingmill MM300, operando a la frecuencia más alta (30 Hertz). El tiempo y la frecuencia podrían tener que optimizarse para otros dispositivos de disrupción, así como para otros materiales de muestra.

NucleoSpin ADN de Levadura

• Lisis optimizada con tubos de perlas MN Tipo C
• Hasta 100 mg de muestra de entrada
• Altos rendimientos de ADN genómico

Para ADN de levadura: ¡No lisar a fuerza, lisar de forma inteligente! 

Los protocolos para el aislamiento de ADN de levadura típicamente incluyen un tratamiento químico para debilitar las paredes celulares, o una lisis mecánica con perlas de vidrio. El primero requiere tiempo adicional de manipulación, el segundo a menudo es ineficiente, lo que lleva a tiempos de lisis prolongados y bajos rendimientos de ADN. El NucleoSpin ADN Levadura contiene tubos de perlas MN Tipo C con perlas de corindón para una lisis más eficiente. El uso de perlas de corindón mejora la lisis, lo que resulta en un aumento drástico del rendimiento de ADN. El kit ofrece rendimientos superiores para varias especies de levadura populares, incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Schizosachharomyces pombe y Pichia pastoris.

Altos rendimientos de ADN y disrupción eficiente de muestras de hasta 100 mg.

NucleoMag ADN Bacterias

• Química de tampones ambientalmente sostenible – sin sales caotrópicas

• Combine con tubos de perlas MN para el procesamiento de una sola muestra o con pocillos MN de 96 perlas para la disrupción de muestras a alto rendimiento

• Proteinasa K líquida y ARNasa A líquida para un manejo fácil

NucleoMag ADN Bacterias

El NucleoMag ADN Bacterias permite el aislamiento de ADN de muestras microbianas diversas, de alto rendimiento y compatible con la automatización. El kit es óptimo para tubos de perlas MN o pocillos de perlas MN para la disrupción mecánica.

Detección competitiva de ADN microbiano

ADN fue aislado de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, así como de levadura utilizando el kit NucleoMag ADN Bacterias (MN, barras azules) en comparación con los kits competidores Q y T (barras grises). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En comparación con los competidores Q (figura A) y T (figura B), los resultados de PCR muestran una amplificación significativamente más temprana (valores de CT más bajos), lo que demuestra una extracción superior de ADN microbiano. La qPCR se realizó para ARNr 16S y ARNr 18S para bacterias y levadura, respectivamente, utilizando el kit Maxima SYBR Green de Thermo Scientific en el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500.

Extracción eficiente de ADN con homogeneización en pocillos y tubo único

Se aisló ADN de diversas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas utilizando el kit NucleoMag ADN Bacterias en combinación con diferentes soluciones para la homogeneización de muestras. Los rendimientos de ADN se determinaron mediante espectrometría UV. Las muestras se homogeneizaron utilizando ya sea portavasos de tiras de tubos prellenados (MN 96 Bead Plates), o tubos de perlas individuales (MN Bead Tubes). Los resultados para muestras homogeneizadas con MN 96 Bead Plates (barras azul oscuro) fueron comparables a los resultados obtenidos con la homogeneización en los MN Bead Tubes (barras azul claro).

Integridad fiable del ADN con homogeneización en pocillos o tubo de una sola cuenta

Se aisló ADN de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas utilizando el kit NucleoMag ADN Bacterias. Las muestras se homogeneizaron simultáneamente utilizando ya sea una serie de tiras de tubos prellenadas (BP = MN 96 Pocillos de perlas) o tubos de perlas individuales (BT = tubos de perlas). Ambos sistemas de homogeneización permiten una extracción fiable de ADN en combinación con el kit NucleoMag ADN Bacterias.

Visión general de los materiales de muestra exitosamente probados

El kit NucleoMag ADN Bacterias ha sido evaluado con varios tipos de muestras y especies diferentes. El aislamiento de ADN exitoso se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa o qPCR.