| NUCLEODUR® HILIC |
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Die Chromatographie sucht stets nach neuen und effektiven Strategien die Herausforderungen der modernen Analytik zu bewältigen. Speziell für polare Verbindungen stößt die Reversed-Phasen-HPLC – die meist gebräuchlichste Analysenmethode – immer wieder an ihre Grenzen. Hier stellen hydrophile, stationäre Phasen eine ideale Ergänzung für die Trennung von polaren Analyten in der HPLC dar.
Der Begriff HILIC (Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) wurde erstmalig 1990 durch Andrew Alpert veröffentlicht [A. Alpert, J. Chromatography 499 (1990), 177–196]. Seitdem wurden einige Anstrengungen unternommen, robuste und reproduzierbare, hydrophile HPLC-Phasen für die HILIC-Chromatographie zu entwickeln.
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HILIC verbindet die Hauptcharakteristika der 3 gängigsten Methoden in der Flüssigkeitschromatographie – Reversed-Phasen (RPC), Normal-Phasen (NPC) und Ionenchromatographie (IC):
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stationäre Phasen (Adsorbentien) sind meistens polar-modifizierte Kieselgele oder Polymere (SiOH, Amino, Diol, (zwitter)ionische, …) – entsprechend der NPC
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mobile Phasen (Eluenten) sind Mischungen von wässrigen Puffersystemen und organischen Zusätzen, wie Acetonitril oder Methanol - entsprechend der RPC
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Anwendungsbereiche erstrecken sich über recht polare Verbindungen, sowie organische und anorganische Ionen - entsprechend der IC
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„HILIC ist NP-Chromatographie von polaren und ionischen Verbindungen unter RP-Bedingungen."
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NUCLEODUR® HILIC ist eine spezielle zwitterionisch-modifizierte, stationäre Phase, basierend auf ultra-sphärisches NUCLEODUR®-Material. Die Betain-Struktur der Ammonium-Sulfonsäure-Liganden bewirkt einen vollständigen Ladungsausgleich mit einer gesamtneutral-geladenen, aber hochpolaren Oberfläche.
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Retentionscharakter
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Im Allgemeinen kann HILIC als Verteilungschromatographie oder flüssig/flüssig-Extraktion zwischen mobiler und stationärer Phase betrachtet werden. Gegenüber der wasserarmen mobilen Phase bildet sich eine „immobilisierte" wasserreiche Schicht auf der Oberfläche der polaren stationären Phase – es erfolgt eine Verteilung der Analyten zwischen diesen beiden Schichten.
Weiterhin zeichnet sich HILIC durch schwache elektrostatische Wechselwirkungen, sowie Wasserstoff-Brückenbindungen zwischen neutralen polaren Molekülen unter hochorganischen Elutionsbedingungen aus. Hierin unterscheidet sich HILIC von der Ionenaustausch-Chromatographie – das Hauptprinzip für die HILIC-Trennung basiert auf der Polarität der Verbindungen sowie deren Solvatisierungsgrad.
Stärker polare Verbindungen haben ausgeprägtere Wechselwirkungen mit der wasserreichen Grenzschicht der stationären Phase als weniger polare Verbindungen – was eine stärkere Retention bewirkt.
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Unpolare Verbindungen weisen infolge weniger hydrophober Wechselwirkungen schnellere Elutionsprofile auf. Dadurch ist die Elutionsreihenfolge auf HILIC-Säulen oftmals umgekehrt zu RP-Säulen, wie auch das Beispiel der Trennung von Uracil und Naphthalin veranschaulicht.
NUCLEODUR® HILIC zeigt ebenfalls eine hervorragende Trennung und Peakform für kritische Verbindungen wie Adenosin und seine Phosphatderivate.
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Stabilität
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Durch ein einzigartiges und modernes Verfahren der Oberflächenmodifizierung (zum Patent angemeldet) sind NUCLEODUR® HILIC-Säulen bereits nach sehr kurzen Equilibrierungszeiten einsatzbereit - nach nur 5 min Konditionierung bzw. Equilibrierung zeigt bereits die 2. Injektion stabile und reproduzierbare Ergebnisse.
Darüber hinaus zeichnen sich NUCLEODUR® HILIC-Säulen durch ihre außergewöhnlich langen Säulenstandzeiten aus - selbst nach ca. 800 Läufen zeigt die Säule keinen Verlust ihrer ursprünglichen Leistungsfähigkeit - Peakform und Retention sind noch immer einwandfrei.
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Anwendungsgebiete von HILIC-Phasen
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| Wegen seiner hohen Beladbarkeit ist NUCLEODUR® HILIC uneingeschränkt für präparative und semi-präparative Anwendungen geeignet.
Durch ihre besonderen Trenneigenschaften sind HILIC-Säulen vor allem für die Bestimmung von mittelpolaren und polaren Analyten anwendbar. Gerade diese Substanzgruppen gewinnen in letzter Zeit zunehmend an Bedeutung.
So sind nicht nur Bestimmungen von polaren Verbindungen aus Lebensmitteln, wie aktuell Melamin in Milch oder Acrylamid in Backwaren notwendig, sondern auch Trennungen von Vitaminen und organischen Säuren in Nahrungsmitteln und Pharmaprodukten. Diese Trennungen lassen sich mit HILIC-Säulen effektiv durchführen.
Auch für pharmazeutische und physiologische Substanzen, wie das Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil, dem Energieträger im Muskelstoffwechsel Creatin, Catecholamine und Aminosäuren, wurden stabile und effektive Applikationen auf NUCLEODUR® HILIC entwickelt.
In der Bioanalytik lassen sich Nucleotide, sowie die Pyrimidin- und Purin-Basen effizient bestimmen.
Da aus Umweltproben zunehmend zwar gutabbaubare, aber immer polarere Pestizide bestimmt werden müssen, gewinnen die Bestimmungen von Substanzen wie Chlormequat, Mepiquat, Paraquat und Diquat weiter an Bedeutung.
Weitere bekannte Anwendungsgebiete für HILIC-Phasen sind Bestimmungen von Kohlenhydraten, Peptiden und glykolisierten oder phosphorylierten Verbindungen. |
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Vorteile der NUCLEODUR® HILIC
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Die NUCLEODUR® HILIC eignet sich hervorragend für die Chromatographie von mittelpolaren, polaren und ionischen Verbindungen.
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Sie zeichnet sich durch kurze Equilibrierungszeiten und gute Standzeiten aus.
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Neben den gängigen Detektionssystemen UV- und Fluoreszenz-Detektion, lässt sie sich auch auf hochsensiblen LC-MS-, LC-MS/MS- und Lichtstreudetektoren anwenden.
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Sie ist die Alternative zu RP-18- und weiteren RP-Phasen, sowie zu NP- und Ionenaustauscher-Phasen für eine sichere Analytik.
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